Két év telt el, amióta a csendes Peter Parker (Tobey Maguire) elhagyta nagy szerelmét, Mary Jane Watsont (Kirsten Dunst), és vállalta a szuperhősléttel járó felelősséget. Peternek számos új nehézséggel kell szembenéznie, miközben arra törekszik, hogy megteremtse az egyensúlyt két élete között – nappal szorgalmas egyetemista, éjjel pedig a szuperhős szerepét ölti magára.

Azok az emberek, akik a legfontosabbak Peter számára, mind veszélyben vannak, attól a pillanattól, hogy összeütközésre kerül sor a gonosz Doc Ockkal. Peter egyre nehezebben bírja Mary Jane nélkül, és egyre erősebb késztetést érez, hogy a kettős életnek és a titkolódzásnak véget vessen. Közben M.J. már továbblépett és éli a maga életét: színészkedik és férfi is van az életében. Peter legjobb barátja, Harry Osborn (James Franco) a Pókemberen még mindig bosszút szeretne állni, mert őt tartja felelősnek apja haláláért.

Még komplikáltabbá válik Peter élete azzal is, hogy Dr. Otto Octavius (Alfred Molina) ellen kell harcolnia. Szüksége van minden természet feletti képességére, hogy megállítsa az elmebeteg gonosztevőt.